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DIA定量蛋白质组学

  • 简介
  • 技术优势
  • 技术路线
  • 研究思路
  • 结果展示
  • 案例展示

  • 随着质谱技术的持续发展，数据非依赖性采集（Data Independent Acquisition, DIA）方法在蛋白质组学研究中迅速崛起，并因其高覆盖率、高重复性和低缺失率等优势而受到广泛关注。DIA通过无偏地采集所有母离子的碎片信息，显著提升了检测深度与定量准确性，尤其适用于复杂样品中低丰度蛋白的识别与分析。
    相比之下，传统的数据依赖性采集（Data Dependent Acquisition, DDA）方法从一级质谱（MS1）中选取信号最强的母离子进行二级质谱（MS2）碎裂分析，虽然可实现高通量检测，但对低丰度肽段覆盖不足，限制了灵敏度和蛋白检测范围[1]。DIA技术正是为了解决这些局限而发展而来， 已逐渐成为定量蛋白质组学的新趋势（图1）。

    图1.采用DDA-MS与DIA-MS方法发表文献数量按年份统计（参考来源：PubMed 2000–2024）

    DDA方法中，一级质谱（MS1）扫描得到的母离子按信号强度排序，选取排名靠前的若干个用于二级质谱（MS2）碎裂分析，用于肽段鉴定与定量。这种选择性采集方式容易遗漏低丰度肽段，降低对复杂样品中低丰度蛋白的检测能力。

    相比之下，DIA方法按预设的m/z窗口分段，无差别地对所有母离子进行碎裂，系统性采集全部MS2信息。其优势在于全面覆盖所有肽段，极大提升了检测深度与数据重复性，更适合复杂样品中低丰度蛋白的检测。



    图2. DDA-MS和DIA-MS采集原理

    DDA-MS通过MS1选择最强信号的母离子进行MS2碎裂分析；DIA-MS则将所有母离子按m/z区间划分，并在MS2中对每个区间内的所有母离子进行碎裂，实现全面定量。

  • · 长色谱分离梯度：使用2小时色谱梯度，支持鉴定到更多肽段。
    · 高灵敏度：避免DDA的选择偏差，显著提升低丰度蛋白的检出率，降低数据缺失率。
    · 高重复性：无差别采集所有离子信息，不同实验间的定量结果一致性更高。
    · 高定量准确性：通过碎片离子的强度积分实现蛋白质的定量，变异系数（Coefficient of Variation, CV）可控制在10%以内。
    · 数据可回溯性：原始数据可反复挖掘，支持后续新蛋白鉴定或功能注释。
    ·  技术扩展性：可根据需求个性化设置窗口宽度，或建立项目专属谱图库，进一步提升鉴定深度。

    · 深度数据分析：采用DIA-NN分析方法，利用深度神经网络以及新的量化和信号校正策略处理DIA数据，精准识别和定量蛋白。

    图3. DIA-MS 与 DDA-MS 相比的优势

    DIA-MS相比DDA-MS能够在同等低样本量的条件下实现更好的重复性、更高的灵敏度以及更大的检测深度。


  • 样品前处理跟常规非标记DDA方法一致，在数据处理阶段，传统DIA数据分析需要通过额外的DDA数据建立谱图库，而随着软件算法的不断发展，直接进行无库的DIA分析逐渐成为可能，且不失去其原来的优点。DIA-NN首次于2020年发表在nature methods杂志，其使用深度神经网络 (DNN) 来区分真实信号和噪声，并采用了新的定量和信号校正策略，可以有效的提高DIA分析结果的蛋白数，并显著提高蛋白的覆盖度[2]。

    图4. DDA-MS和DIA-MS实验流程对比

    (A) 在DDA-MS实验流程中，从样品中提取的蛋白质被消化后，可以直接利用单次DDA-MS分析获得整个蛋白质组的检测结果（实线箭头），也可以对单个蛋白组分进行分离之后再用DDA-MS检测（虚线箭头）。质谱获取的数据可在蛋白质数据库中进行搜索，并通过软件工具进一步定量分析。
    (B) 在DIA-MS实验流程中，蛋白质被消化后可直接用DIA-MS进行分析，DIA生成的复杂质谱结果使用参考数据库进行蛋白质的鉴定和定量（实线箭头），也可以由同一样品额外进行DDA-MS分离、分析特定的蛋白进行检测（虚线箭头），因此DIA-MS比DDA-MS在检测的方法上更加全面。

  • 图5. DIA-MS研究思路

  • DIA定量蛋白质组学可提供以下结果：质谱原始数据，蛋白质鉴定及定量列表，生物信息学分析结果。


    1.差异蛋白GO/pathway分析



    2.差异蛋白火山图


    3.差异蛋白PPI互作网络图

  • 表1. DIA-MS 在癌症研究的应用

    图6. DIA-MS在癌症研究中的应用

    DIA-MS可以接受细胞、临床组织以及FFPE固定样品，并且已被应用到蛋白组学定量检测、生物标志物筛选、临床治疗反应、多组学联合分析等各种研究领域中，成为疾病研究、特别是癌症研究中不可忽视的重要实验方法。

    DIA技术凭借其高覆盖、高重现性和精准定量能力，已成为蛋白质组学研究的核心工具，广泛应用于疾病机制、药物开发、生物标志物筛选等领域。随着算法和硬件的持续优化，DIA将推动蛋白质组学向更高分辨率、更大规模队列分析方向发展。


    参考文献
    1.Krasny, L. and P.H. Huang, Data-independent acquisition mass spectrometry (DIA-MS) for proteomic applications in oncology. Mol Omics, 2021. 17(1): p. 29-42.
    2.Demichev, V., et al., DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 2020. 17(1): p. 41-44.